PCR擴增儀的常見問題

一、沒有擴增產(chǎn)物 1、循環(huán)溫度：變性溫度、退火溫度 2、引物設(shè)計 3、DNA聚合酶活性 4、抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份) 5、DNA樣品

二、非特異產(chǎn)物及電泳呈涂布狀 1、Mg2+濃度 2、調(diào)整引物、模板、聚合酶的用量3、適當減少循環(huán)數(shù)4、適當提高退火溫度，縮短退火或延伸時間?

三、引物二聚體的形成 1、檢查引物的序列 2、提高退火溫度 3、調(diào)整引物與模板濃度4、增加引物長度四、假陽性結(jié)果的預(yù)防 1、實驗器材應(yīng)一次性使用(吸咀、PCR管) 2、注意操作環(huán)境，戴一次性手套 3、嚴格PCR操作規(guī)程 4、多次取樣的試劑應(yīng)分裝 5、設(shè)置陰性對照和陽性對照 PCR

相關(guān)技術(shù)

一、錨定PCR(anchoredPCR)：引進錨定引物，可以幫助克服序列未知或序列未全知的障礙。在DNA3’-末端加上poly(dG)尾，與此相對應(yīng)的錨定引物poly(dC)一般應(yīng)在十二聚以上。

二、稱PCR(asymmetric PCR)不對稱PCR主要是在PCR體系中設(shè)計不同的引物濃度，兩條引物濃度比為1：50或1：100，前12個循環(huán)兩條模板等量擴增，之后低濃度引物消耗殆盡，其擴增產(chǎn)物減少以至于無；而高濃度引物介導(dǎo)產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物（即單鏈DNA）逐漸增加，可得到大量單鏈DNA（ssDNA）用于直接測序。

三、反向PCR(inverse PCR)

四、多重PCR(multiplex PCR) 多重PCR是用多對引物同時對模板DNA上的多個區(qū)域進行擴增。多重PCR技術(shù)的難點不是在于其原理和操作的復(fù)雜性，而是在于其多對引物的設(shè)計，必需**多對引物之間不形成引物二聚體，引物與目標模板區(qū)域具有高度特異性。應(yīng)用于基因診斷，對與**相關(guān)的基因（龐大）進行擴增檢測。

五、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse?transcription?PCR,RT-PCR) 由mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA鏈作為PCR反應(yīng)模板。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時，引物可選用特異引物、隨機六聚體引物或寡聚dT(12-18)。設(shè)計RT-PCR的引物時*好是分散在不同的外顯子上，以免基因組DNA的污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

六、差別PCR(differential PCR) 差別PCR是將靶基因與已知拷貝的參照基因置于同一PCR反應(yīng)體系中，用同一套引物進行擴增，電泳染色后可根據(jù)參照基因的擴增產(chǎn)物與待測基因擴增產(chǎn)物的相對豐度對待測基因進行定量。

七、原位PCR(In situ PCR) 原位PCR是指在組織或細胞標本片上直接進行PCR，對細胞中的靶DNA進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結(jié)合原位雜交進行檢測的方法?？煞譃橹苯臃ê烷g接法?；静襟E：組織切片或細胞固定→蛋白酶消化→原位PCR擴增→沖洗→產(chǎn)物檢測*點：靈敏度高，可進行細胞內(nèi)定位。

八、熒光定量PCR(FQ-PCR) 熒光定量PCR：融匯PCR技術(shù)、DNA探針雜交技術(shù)(標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團)，結(jié)合**的光譜檢測技術(shù)發(fā)展起來的一項新技術(shù)。主要原理是在待擴增區(qū)域結(jié)合上DNA探針，PCR過程中，具有5’→3’外切酶活性的Taq酶延伸引物鏈到DNA探針時，將DNA探針逐個降解，釋放出熒光報告基團，這樣PCR體系中熒光的強度與PCR產(chǎn)物量之間存在正比關(guān)系，可通過測定熒光強度而對PCR產(chǎn)物定量。

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