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PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析,PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增,其結(jié)果是否**可靠,必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定,才能得出正確的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析,可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。凝膠電泳分析:PCR產(chǎn)物電泳,EB溴乙錠染色紫外儀下觀察,初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致,特別是多重PCR,應(yīng)用多對(duì)引物,其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小,這是起碼條件。
瓊脂糖凝膠電泳:通常應(yīng)用1~2%的瓊脂糖凝膠,供檢測(cè)用。聚丙烯酰胺凝膠電泳:6~10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好,條帶比較集中,可用于科研及檢測(cè)分析。酶切分析:根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn),用相應(yīng)的酶切、電泳分離后,獲得符合理論的片段,此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定,又能對(duì)靶基因分型,還能進(jìn)行變異性研究。
分子雜交:分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù),也是檢測(cè)PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。Southern印跡雜交: 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針,與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定,又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度,還可知其分子量及條帶形狀,主要用于科研。斑點(diǎn)雜交:將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上,再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交,觀察有無著色斑點(diǎn),主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。核酸序列分析:是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的*可靠方法。
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